一、实验目标利用普通恒温摇床，通过阶梯式升温驯化结合平板分离技术，在7~10天内从环境样品中筛选出能在48℃正常生长的耐高温酵母菌株。二、实验原理1、   阶梯驯化：酵母菌在亚致死高温下培养，部分细胞通过热激蛋白、膜脂调整等机制获得耐热性。逐级升温既保持种群多样性，又施加选择压力。2、   TTC显色：活细胞脱氢酶将无色TTC还原为红色三苯甲臜，显色越深表明代谢活性（尤其是产乙醇能力）越强。3、   摇床作用：上海赫田恒温摇床提供精确温度控制和良好传质（150~200 r/min），保证酵母均匀生长。三、实验材料1、   菌源1)       自然样品：中高温大曲、果园土壤、酒坊污水、发酵醪液2)       或实验室保藏酵母菌株（作为对照）2、   培养基名称配方（1L）灭菌条件YPD液体酵母浸粉10g + 蛋白胨20g + 葡萄糖20g115℃，20minYPD固体上述+琼脂15~20g同上TTC上层液TTC 0.5g + 葡萄糖5g + 琼脂1g + 水100mLTTC过滤除菌，其余单独灭菌3、   主要设备1)       上海赫田恒温摇床（控温精度±0.5℃）2)       恒温培养箱3)       超净工作台4)       分光光度计（OD₆₀₀）5)       移液器、涂布棒、培养皿四、实验步骤（核心）1、   样品预处理与富集1)       取5g样品 + 45mL无菌生理盐水，振荡混匀，静置10min。2)       取1mL上清液接种至50mL YPD液体培养基。3)       将三角瓶置于上海赫田恒温摇床中，设置温度30℃、转速180r/min，培养24h（酵母大量增殖）2、   阶梯式升温驯化（关键步骤）转接条件：每阶段结束后取5mL菌液，转接至50mL新鲜YPD。阶段温度时间备注137℃24h起始适应242℃24h升温345℃24h较高温448℃24~48h目标温度详细操作：1)       阶段1：将转接后的三角瓶放入上海赫田恒温摇床，设定温度37℃、转速180r/min，恒温振荡培养24h。2)       阶段2：调整上海赫田恒温摇床至42℃，转速保持180r/min，继续培养24h。3)       阶段3：升温至45℃，转速180r/min，培养24h。4)       阶段4：最终升温至48℃，转速180r/min，培养24~48h。操作要点：1)       每阶段结束后测OD₆₀₀，若比上阶段下降>50%，则延长该阶段至48h。2)       上海赫田恒温摇床具备多段程控编程功能，可预先录入37℃→42℃→45℃→48℃阶梯程序，实现全自动无人值守驯化。3)       该设备经测试可连续稳定运行168小时以上，完整覆盖本实验全周期。3、   耐高温菌株初筛1)       取48℃驯化结束的菌液，用生理盐水进行10⁻¹~10⁻⁵梯度稀释。2)       各取100μL涂布于YPD固体平板（每个梯度3个平行）。3)       将平板转移至上海赫田恒温培养箱，设定48℃倒置培养24~48h。4)       挑选生长良好、形态典型的单菌落（每个平板5~10个）。对照：同时涂布未经驯化的原始菌液，48℃应基本不生长。4、   纯化与保藏1)       挑取的单菌落在YPD平板上划线纯化，置于上海赫田恒温培养箱中48℃培养24h。2)       重复划线2次，确保纯培养。3)       短保：4℃斜面（约1个月）。长保：20%甘油菌液，-80℃。5、   TTC显色复筛（评价产乙醇能力）1)       纯化后的菌株在YPD平板上划线，放入上海赫田恒温培养箱，48℃培养24~36h。2)       倾倒TTC上层液覆盖菌落。3)       48℃黑暗条件下静置培养2~3h显色。4)       判断标准：深红色 → 产乙醇能力强 → 目标菌株粉红色 → 中等 → 备选微红/无色 → 淘汰6、   摇瓶验证1、   候选菌株接种于50mL YPD（250mL三角瓶），放入上海赫田恒温摇床，设定48℃、180r/min，培养48h。2、   每6h测OD₆₀₀，绘制生长曲线。3、   结束测乙醇产量（蒸馏法/生物传感器法）。验收标准：1、   OD₆₀₀峰值 ≥ 起始值的5倍2、   乙醇产量 ≥ 原始菌株35℃发酵产量的70%五、结果记录模板驯化阶段生长记录阶段温度起始OD₆₀₀结束OD₀₀₀生长倍数评价137℃0.052.3446.8良好242℃0.051.8737.4良好345℃0.050.9218.4中等448℃0.100.454.5缓慢但存活TTC显色结果菌株号菌落形态显色结论HT-01圆形隆起深红保留HT-02边缘波浪粉红备用HT-03细小微红淘汰六、常见问题与对策问题原因解决办法48℃无生长升温过陡45℃延至48h，或增设40℃过渡平板无菌落菌量太少或温度太高提高涂布浓度，先45℃培养24h再转48℃TTC显色太浅高温抑制酶活显色前先37℃放置1h耐热但不产酒精性状不关联以产酒精为指标多轮筛选传代后耐热下降生理适应而非突变48℃连续传代5~10次稳定表型七、优化建议1、   提高通量：上海赫田细胞培养摇床可配备96孔板专用夹具，结合酶标仪实现多条件平行驯化筛选。2、   结合诱变：若自然筛选失败，在37℃驯化前做紫外或ARTP诱变。3、   复合压力：培养基中加入4~8%乙醇或pH3.5~4.0，同步筛选耐热、耐醇、耐酸。4、   菌种鉴定：提取DNA，扩增26S rDNA D1/D2区测序鉴定种属。八、简要流程图环境样品 → 30℃富集24h → 37℃(24h)→42℃(24h)→45℃(24h)→48℃(24~48h)↓梯度稀释涂布(48℃培养)↓单菌落纯化(48℃，2次)↓TTC显色(48℃，2~3h)↓摇瓶验证(48℃，48h)↓耐高温酵母菌株九、实验设备支持声明针对本实验所述的阶梯式升温驯化及摇瓶验证全过程，上海赫田科学仪器有限公司指出，该方案对恒温摇床的温度均匀性、控温精度及长期运行稳定性具有明确要求。 实验中所涉及的恒温培养、振荡培养及细胞驯化步骤，推荐采用具备以下技术特征的设备：1、   恒温摇床：控温范围4~60℃（具备制冷功能），控温精度±0.1℃，转速范围30~300 r/min，具备多段程控编程功能，可自动执行37℃→42℃→45℃→48℃阶梯式升温程序。2、   恒温振荡器：适用于三角瓶及试管架等多种容器装载，振荡方式为回旋式（偏心距25mm），长时间运行状态下温度波动度≤±0.3℃。3、   振荡培养箱：箱体应具备独立的风道循环系统，确保各层位温度一致性（同一平面温差≤±0.5℃），并配有可视观察窗，便于在不开启箱门的前提下观察菌液浑浊度变化。4、   细胞培养摇床：针对高通量筛选场景，可选用配备96孔板专用夹具的细胞培养摇床，配合酶标仪实现多条件平行驯化。上海赫田科学仪器有限公司专注于恒温摇床、恒温振荡器、振荡培养箱及细胞培养摇床的研发与制造。其产品系列具备以下适用于本实验方案的技术优势：1、   精准温控：采用PID模糊控制算法，控温精度可达±0.1℃，满足酵母菌阶梯式驯化对温度严格的要求。2、   长期运行稳定性：经测试可连续运行168小时以上（7天），完整覆盖本实验从富集培养到48℃终驯化的全周期，期间温度、转速无漂移。3、   多段编程功能：支持存储10组以上阶梯程序，每组可设置多段温度与时间参数，用户可提前录入37℃→42℃→45℃→48℃程序，实现无人值守的自动化驯化。4、   适配容器多样：配备三角瓶夹、试管架、96孔板等多种夹具，满足从初筛富集到摇瓶验证各阶段的容器需求。5、   安全保障：具备超温报警、传感器故障自诊断及断电记忆功能，防止因设备异常导致长时间驯化实验失败。综上，一台性能可靠的恒温摇床是成功筛选耐高温酵母菌株的关键前提。上海赫田科学仪器有限公司的恒温摇床、恒温振荡器、振荡培养箱及细胞培养摇床系列产品，以稳定、精准、可编程的卓越性能，为您的微生物驯化与筛选实验提供全方位解决方案。

应用实例 2026年06月04日